【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng)：豬細小病毒檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱(chēng)：Porcine pamovirus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規格】 25 T/盒 & 50 T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理，定性檢測豬細小病毒，對豬細小病毒引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對豬細小病毒的高度保守區域設計特異性引物和探針，在反應體系中含豬細小病毒基因組模板的情況下，PCR反應得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用熒光定量PCR儀對PCR過(guò)程中相應通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監測和輸出，實(shí)現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25 T/盒 | 50 T/盒 |
1 | PPV RT-PCR反應液 | 437.5 μL×1管 | 875 μL×1管 |
2 | PPV混合酶液 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
3 | PPV陽(yáng)性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | PPV陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為豬基因組DNA，陽(yáng)性對照為經(jīng)滅活處理的豬細小病毒核酸提取物。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.70日齡以?xún)攘鳟a(chǎn)胎兒、死胎、木乃伊胎及弱仔的腦、腎、睪丸、腸系膜淋巴結或母豬的胎盤(pán)、陰道分泌物和精液均可作為檢測病毒的材料。以腸系膜淋巴結和肝臟檢出率最高。
2.血液或血清樣品：使用無(wú)菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
3.肌肉或內臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉入無(wú)菌離心管中，3000 rpm 離心10分鐘取上清待檢。
4.應避免標本間交叉污染。
5.標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(cháng)期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著(zhù)液體。
（2）核算當次實(shí)驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實(shí)驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽(yáng)性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 17.5 μL |
混合酶液 | 2.5 μL |
(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區）
用QIAGEN、Roche公司病毒提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。陰性對照和陽(yáng)性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽(yáng)性對照品，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉移到PCR儀器上。
4. PCR（PCR擴增區）
（1）取樣本處理區準備好的PCR反應管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關(guān)參數進(jìn)行PCR擴增。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集豬細小病毒熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
UNG酶 | 50℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時(shí)采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時(shí)不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對照：有典型S型擴增曲線(xiàn)或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線(xiàn)形為直線(xiàn)或輕微斜線(xiàn)，無(wú)指數增長(cháng)期。
2.標本結果判定：
（1）陽(yáng)性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長(cháng)期。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內。此時(shí)應對標本進(jìn)行重復檢測，如重復實(shí)驗結果Ct值仍在35～38范圍內，有明顯指數增長(cháng)期，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗結果的解釋】
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì )發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中操作方式不當容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽(yáng)性結果。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為102 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%。
【注意事項】
1. 整個(gè)檢測過(guò)程應嚴格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準備區、樣本處理區和PCR擴增區進(jìn)行操作，各區實(shí)驗服、儀器、耗材應獨立使用，不能混用；實(shí)驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區應配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區應該配有紫外線(xiàn)殺菌裝置。
2. 為避免RNA降解，樣本處理過(guò)程應在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗后立即上機檢測；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理。
3. 每次實(shí)驗應該設置陰、陽(yáng)性對照。
4. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時(shí)離心。
5. 試劑盒內所配陰性和陽(yáng)性對照在第yi次使用前應全部轉移至標本準備區，并單獨存放。
6. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管，并應避免在PCR反應管上進(jìn)行任何標記。
7. 儀器擴增相關(guān)參數應按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設置；不同批號試劑不能混用。
8. ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None。
9. 實(shí)驗過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄。
